IMPIEGO DI PARTICELLE DI FERRO (MICROTRACERS©) COME TRACCIANTI DEI

MANGIMI E PER IL CONTROLLO DELLA MISCELAZIONE

THE USE OF COLORED UNIFORMLY SIZED IRON PARTICLES (MICROTRACERS©) IN

TESTING THE PRESENCE AND UNIFORMITY OF A FEED INGREDIENT IN THE DIET

Bagliacca M., Paci G., Marzoni M., Lisi E.


Summary

Microtracers© consisting of uniformly sized iron particles colored with codified food dyes (MicroTracers, Inc., San Francisco) were incorporated into an experimental antioxidant premix (Rosmarinus officinalis, vitamin E and C, differing in vit E content). 1.25, 2.50, 3.75, and 5.00 g of blue or red particles per 100 kg of food were added to 5 different feed to give concentrations of 31, 63, 94, and 125, particles per 100 g of food. Vit E supplementation was 25 mg/kg (2 pellet), 50 mg/kg (1 pellet) and 200 mg/kg (2 pellet). Pellets, grinded to mash, were assayed, by Microtracers ©-Rotary detector, for colored iron particles presence and; by HPLC, for vit E content.

Sufficient relationships were found between theoretical and practical recoveries (avg.=69±22%). Repeatability, controlled on the same color by sub-sampling and between the two color, was R2 = .71, .75 and .73 for red, blue and red vs. blue, respectively. Traceability of premix was secured by the presence of more than one colored iron particle in every sample. Sufficient relationship were found between analyzed vit E-content and estimated vit E-content (R2-=.987 blue and R2=.985 red).

The use of microtracers can give an easy, cheap, and rapid method to control diet uniformity by the use of Poisson statistics and related chi-square calculations on counted spots. In addition, use of microtracers technique can be used, in a non laboratory environment, for semi quantitative detection of ingredients (premix, drugs and so on) added to feed in small quantities.

Riassunto
Per la prova sono stati preparati 5 mangimi, nei quali è stato aggiunto un premix antiossidante sperimentale (estratto di rosmarino, vit. C e vit. E) the differiva per il contenuto di vit. E (acetato di dl-atocoferolo): 25 mg/Kg (due diete), 50 mg/Kg (una dieta) a 200 mg/Kg (due diete). II premix è stato preventivamente miscelato con due diversi tipi di particelle di ferro di calibro uniforme colorate con un diverso tracciante (25.000 particelle/g; 97% Fe, 3% colorante naturale blu o rosso Microtracers© F-BLUE a Microtracers© F-RED) in modo tale che, nei mangimi finiti, vi fossero incorporate, per ciascuno dei due microtraccianti, 1,25,2,50, 3,75 (due diete), a 5,00 g per 100Kg di alimento. L'aggiunta teorica di 31, 63, 94 a 125 particelle per 100 g di mangime pellettato è stata quindi controllata con l'impiego del Rotary detector della Microtracers© e il contenuto in vit. E tramite HPLC.

La percentuale di ricoperti delle particelle è oscillata dal 62 al 78% (media=69±22%). La riproducibilità, controllata per to stesso colore di microtracciante su due sottocampioni e, sullo stesso campione, fra microtraccianti di diverso colore, ha presentato un coefriciente di determinazione di 0,71 per il rosso, 0,75 per il blu a 0,73 fra i due colori. Nessuno dei campioni esaminati è risultato privo di particelle microtraccianti per cui la tracciabilità è risultata garantita anche alla dose più bassa. La regressione fra il contenuto in vit. E analizzato a quello stimato tramite i microtraccianti ha mostrato valori di R2= 0,985 per il rosso a R2= 0,987per il blu.

I risultati confermano the la tecnica di miscelare nei mangimi particelle di ferro micro-calibrate e colorate pu_ costituire un metodo rapido ed economico per la tracciabilità dei microingredienti, per il controllo dell'uniformità di miscelazione a per il controllo, semi quantitativo, dei microingredienti tracciati.

Introduzione
La corretta miscelazione è uno degli elementi più importanti nella produzione dei mangimi commerciali. Il primo scopo del processo di miscelazione è quello di omogeneizzare il più uniformemente possibile le particelle di diversa grandezza a densità delle materie prime the vengono impiegate per formulare 1'alimento. L'importanza della corretta miscelazione è spesso trascurata, anche se vengono osservati non pochi problemi, particolarmente, quando all'alimento vengono aggiunti i microingredienti (vitamine farmaci ecc.) per i quali, in condizioni estreme, errori di miscelazione possono condurre a casi di tossicità (Moncada,1999).

Nell'alimentazione delle cosi dette piccole specie (avicoli conigli a pesci) il consumo giornaliero di mangime pu_ scendere al di sotto dei 100 g, conseguentemente la imperfetta miscelazione (variabilità dell'ordine del 10-20%) puo' determinare problemi di microcarenze the causano difformità di crescita a riduzione di performance generalizzate (Amornthewaphat et al., 1998). Nell'industria mangimistica per le piccole specie sarebbe buona pratica controllare regolarmente la corretta miscelazione, ma, la determinazione di un contenuto di un componente specifico della dieta comporta costose analisi che, per tale motivo, vengono effettuate raramente o solo a posteriori, quando un problema viene segnalato dagli allevatori. Sarebbe inoltre indispensabile per le ditte produttrici dei mangimi controllare la presenza e/o 1'assenza di micro e macro ingredienti particolari nella formulazione finale ma, anche in questo caso, il costo delle analisi limita molto il reale controllo di produzione. È in assenza di tali controlli che, nel passato, si è verificato il noto problema legato alla presenza, spesso non fraudolenta, di farine animali negli alimenti per ruminanti. Non è escluso the senza tracciare gli ingredienti, in futuro, potrà continuare a verificarsi, sia la presenza di sostanze non ammesse in mangimi per specie diverse da queue per le quali i prodotti sono registrati, sia la presenza di inhibitori in mangimi non medicati.

Il diffuso impiego di microtraccianti degli ingredienti, qualora il dosaggio degli stessi si rivelasse rapido, facile, economico e ripetibile, potrebbe essere quindi estremamente utile per migliorare la qualità dei mangimi prodotti.


Materiali a metodi

Per la prova sono stati preparati 5 mangimi, nei quali è stato aggiunto un premix antiossidante sperimentale the differiva per il contenuto di vit. E (acetato di dl-a-tocoferolo): 25 mg/Kg (due diete), 50 mg/Kg (una dieta) e 200 mg/Kg (due diete). Il premix è stato preventivamente miscelato con due diversi tipi di particelle di ferro di calibro uniforme colorate con un diverso tracciante (25.000 particelle/g; 97% Fe, 3% colorante naturale blu o rosso - Microtracers© F-BLUE e Microtracers© F-RED) in modo tale che, nei mangimi finiti, vi fossero incorporate, per ciascuno dei due microtraccianti, 1,25, 2,50, 3,75 (due diete), a 5,00 g per 100Kg di alimento.

Gli ingredienti sono stati miscelati in un miscelatore orizzontale in acciaio inox con doppia elica posizionata sull'asse centrale, i componenti maggiori (mangimi semplici quali erba medica disidratata, orzo, crusca ecc) sono stati pesati e caricati preventivamente mentre il premix microtracciato è stato immesso successivamente direttamente dalla sommità del miscelatore. Il tempo di miscelazione per tutti i mangimi è stato mantenuto costante a 10 minuti. Successivamente gli sfarinati sono stati trasferiti alla pellettatrice mediante un sistema automatico misto (coclea + nastro a tazze) a cubettati con vapore secco a 175°C (pellet Ø = 3mm, L = 15 mm). I pellet ottenuti, previo raffreddamento a passaggio in trabatto con riciclo, sono stati quindi insaccati in sacchi da 25Kg e trasportati all'allevamento sperimentale (circa 50 Km) dove, da ogni sacco, è stato estratto un campione casuale di circa 200-300g per le analisi.

Ciascun campione è stato quindi macinato, per disgregare i pellet (mulino a martelli con griglia da 2 mm), omogeneizzato a suddiviso in due sottocampioni da 50g ciascuno (bilancia tecnica). Ciascun sottocampione è stato versato su una carta da filtro (Ø = 7.5cm) posta sul magnete rotante del rotary detector della Microtracers©; una volta the tutto il campione è passato sul magnete rotante, la carta da filtro è stata rimossa, le particelle depositatesi circolarmente sulla stessa sono state demagnetizzate tramite un "bulk tape eraser" a disperse su un filtro circolare (Ø = 18.5cm)

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posto su un vetro a imbibito con una soluzione idroalcolíca al 50%. Le carte da filtro sono state quindi trasferite in stufa statica a +65°C ed i punti rossi a blu sono stati contati manualmente e separatamente da due diversi operatori.

4 campioni per ciascuna dieta, recuperati dal rotary detector e privi dei microtraccianti, sono stati quindi sottoposti a saponificazione ed estrazione con etere etilico per la determinazione del contenuto in vitamina E 
(a-tocoferolo, McMurray et. Al., 1980).

1 risultati delle conte effettuate sono stati sottoposti ai seguenti controlli:
- omogeneità di miscelazione dei pellet sperimentali, mediante studio della distribuzione di Poisson a analisi del chit (somma dei quadrati degli scarti dalla media delle conte diviso la media stessa) 
(Snedecor and Cochran, 1984; Treolar, 1939).
- riproducibilità delle conte effettuate dallo stesso operatore, tramite analisi dei coefficienti di regressione a di determinazione fra due sottocampioni dello stesso tracciante a dei due traccianti nello stesso campione;
- percentuale di recupuro, mediante studio del coefficiente di variazìone della differenza fra le particelle aggiunte a recuperate;
 soggettività delle letture, mediante analisi dei coefficienti di concessione a di determinazione fra conte effettuate da due diversi operatori;
I risultati delle analisi della via E sono stati sottoposti all'analisi delle regressioni rispetto ai valori stimati con la tecnìca dei microtraccianti.


Risultati a discussione

Nella tabella n 1 sono riportate, per ciascuna concentrazione di tracciante, la media dei punti con le relative misure the ne descrivono la variabilità (deviazione standard d.s., coefficiente di variazione c.v., coefficiente di variazione di Poisson Poisson e significatività dello spostamento dalla distribuzione di Poisson chit). Come si pu_ notare il ritrovamento delle particelle in tutte le diete non è differito significativamente da quello the si ottiene in miscele teoricamente perfettamente distribuite. Se il mangime è perfettamente miscelato, infatti, il numero delle particelle colorate, rinvenute nei diversi campioni, non si discosta dalla variabilità caratteristica della distribuzione di Poísson. Solo nel caso di mangimi non completamente miscelati o demiscelati, la distribuzione di Poisson evidenzia una variabilità maggiore, attestata dai valori significativi di chi2. I risultati ottenuti dalle analisi confermano quanto era prevedibile in funzione della tecnica di miscelazione adottata, the consente la preparazione di mangimi correttamente miscelati se vengono scrupolosamente rispettati i tempi e le modalità di inserimento dei singoli ingredienti.


Tabella n. 1 - Caratteristiche dei campioni di mangime analizzati.
Campioni Punti 1,25g/100kg 2,50g/100Kg 3,75/100Kg 5,00g/100Kg
  rosso blu rosso blu rosso blu rosso blu
                         n                        24                                         24                          44                        88
                                  n 12 11 21 19 33 32 48 40
                               d.s 1,8 3,3 4,0 4,6 6,3 6,1 6,9 1,3
                               c.v. 15,0 29,9 19,2 23,4 19,0 18,7 14,4 3,3
                          Poisson 28,5 30,1 21,9 22,7 17,4 17,6 14,5 15,9
                            Chi2 6,3 22,7 17,8 24,5 51,3 47,7 6,9 0,3

Per quanto riguarda la precisione del metodo di analisi adottato, si puo´ notare come la riproducibilità delle conte, effettuate dallo stesso operatore su due sottocampioni con to stesso tracciante e sui due traccianti nello stesso campione, sia piuttosto elevata (vedi tabella 2). Va rilevato pero the il tracciante di colore blu si evídenzia sempre con più difficoltà sulla carta da filtro, tanto the il numero di particelle ritrovate è costantemente minore (vedi tabella 1). In ogni caso la riproducibilità, anche per questo colore risulta più the accettabile a addirittura superiore a quella the si ottiene con i microtraccianti rossi.                                              
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Tabella n. 2 - ri roducibilità delle analisi dei cam ions

                     b      R2
Traccianti rossi                  0,81      0,71
Traccianti blu                  0,78           0,75
Fra traccianti di diverso colore                  0,91      0,73

La percentuale di particelle colorate the si ritrovano nel mangime rispetto a quelle immessevi risulta invece abbastanza ridotta: si perde infatti mediamente il 31 % delle particelle, vedi tabella 3. Al fine di valutare la validità della tecnica analitica abbiamo infatti operato volutamente nelle peggiori condizioni possibili, non solo dopo la miscelazione il mangime è stato pellettato, ma prima del prelievo dei campioni, to stesso è stato sottoposto a tutte le operazioni di routine the ne possono condizionare la qualità (insaccamento, carico, trasporto, scarico e immagazzinamento). La pellettatura ha comportato inoltre l'indispensabìle operazione di disgregazione dei pellet prima delle analisi, quindi un'ulteriore operazione the sicuramente ha favorito la perdita di colore da pane delle micro particelle di ferro. Va notato comunque come, anche con il dosaggio più basso, 1.25g/100Kg di mangime, corrispondente a 31 particelle per 100 g di alimento, (16 particelle in 50g) non si sia mai riscontrato un campione con meno di quattro particelle evidenziate, ci_ conferma quindi l'attendiibilità di tale tecnica anche per la tracciabilità degli integratori non desiderati a di lavorazioni precedents (Corrigan et al, 1994; Eisenberg, 1998, 1999).


Tabella n. 3 - Recupero delle particelle colorate nel pellet. rosso blu indipendentemente da colore
  rossa blu independentemente da colore
  % c.v % c.v % c.v.
1,25g/100kg 77 16 67 35 72 27
2,5g/100Kg 63 22 62 27 62 25
3,75g/100Kg 71 20 68 20 69 20
5g/100Kg 78 14 64 6 71 15
Media 72 18 65 22 69 22


La soggettività della lettura delle particelle, anche se effettuata manualmente dall'analista, è risultata sempre accettabile (valore minimo di R2= 0,80 per un contenuto teorico di 31 particelle rosse/100 g di campione analizzato). Tale operazione puo essere inoltre resa automatica a oggettivabile tramite 1'impiego di un programma di analisi delle immagini abbinato ad un opportuno software, ma questa operazione, the rende l'analisi meno rapida ed economica, in quanto si richiede 1'impiego di uno scanner abbinato ad un computer per la lettura delle carte da filtro, risulta non strettamente necessaria a la semplice conta numerica dei punts colorati, evidenziatisi sulla carta da filtro, garantisce una riproducibilità sufficiente, vedi tabella 4.

 Tabella n. 4 - Soggettività della conta delle particelle
                         rosso                    blu indipendentemente da colore
               b       R2         b          R2         b      R2
                         1,25g/100Kg         +0,77     0,80      +0,96     0,98     +0,95     0,96
                           2,5g/100Kg        +0,98     0,89      +1,12     0.97     +0,97    0,93
                         3,75g/100Kg       +0,82     0,97     +1,00     0,98     +0,91    0,98
                              5g/100Kg       +1,27    1,00     +1,30     0,96    +1.43    0,98
                                  Totale       +1,01       0,98    +1,06     0,99     +0,98     0,99



La capacità di stima del contenuto di vitamina E tramite i microtraccianti risulta attendibile alle diverse concentrazioni (25, 50 e 200 mg/kg) come è possibile rilevare dalla dispersione dei punts sulle rette di regressione riportate nella figura 1 (R2 = 0,987 per il blu e R2= 0,985 per il rosso). Cio´ risulta particolarmente interessante anche in considerazione del fatto che il contenuto di vit E del

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mangime origina sia della vitamina sintetica tracciata the della vitamina naturale contenuta negli alimenti semplici. Inoltre, come è noto, il processo di pellettatura comporta una certa perdita vitaminica stimata intorno al 5 15% 
(Putnam & Taylor, 1997).



Conclusioni
I risultati confermano che l'impiego di microparticelle di ferro calibrate a colorate da miscelare a
ingredienti the si vogliono "tracciare" nei mangimi, oltre a consentire analisi di controllo rapide ed
economiche (Calderon et al., 2000), risulta utile sia per la tracciabilità dei diversi componenti nei
mangimi finiti, sia per il controllo dell'uniformità di rniscelazione, sia per l'analisi, semi
quantitativa, dei microingredienti tracciati.

Bibliografia
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Corrigan O.J., Wilkinson M.L., Ryan J., Harte K., and Corrigan O.F, (1994) The use of Microtracers© in a medicated premix to determine the presence of tiamulin in final feed. Drug Development and Industrial Pharmacy 20 (8): 1503-1509.
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 Ringraziamenti
Si ringrazia per la collaborazione la Microtracers© Inc., San Francisco (http://www.microtracers.com/) a la Vitaminol Srl Ponsacco.

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